A múmiák szöveteinek mintáit "Maria" (Maria) és "Vavita" (Wawita) néven Peruból egy orosz laboratóriumba küldték kutatás céljából. A mellékelt biológiai szövetek mintáit pásztázó elektronmikroszkópos, Raman-spektrumokkal, ICPE-vel tanulmányoztuk, és megvizsgáltuk a diatomaföld összetételét (egy anyag a múmiák bőrének felületén). Vizsgáltuk a transzferált szövetek DNS-ét is.
A minta előkészítése
Az 500 μg-os szövetmintákat áthelyeztük műanyag csövekbe és feloldottuk 1 ml pufferben (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). A kapott szuszpenziókhoz nátrium-dodecil-szulfátot adunk 0,5% -ban, +80 ° C-ra melegítjük, és 10 perc elteltével a proteináz K-t (legfeljebb 500 μg / ml) 24 órán át termosztátba helyezzük (+55 ° C).
A proteinek eltávolítását fenolos módszerrel hajtottuk végre: fenol hozzáadása a szuszpenzióhoz azonos térfogatú, majd fenol: kloroform (1: 1), kloroform; minden egyes adagolás után állandó keverést hajtottunk végre egy sarokforgórészen és centrifugálással 15 ezer fordulat / perc sebességgel, 10 percig.
A 3. centrifugálás után kapott szuper-üledékhez az elegy 1 térfogatának 1 M részét nátrium-kloriddal és 2,5 térfogat kétszer desztillált etil-alkohollal adtunk, majd éjszakán át -30 ° C-on kúpos kémcsövekben - "Eppendorf" - hagytuk. A centrifugálást 15 ezer térfogattal végeztük. min. 10 percen belül, és a kapott DNS "kicsapódik" barna csapadék formájában. A DNS-üledéket kétszer mostuk 70% etil-alkohollal, szobahőmérsékleten (1 óra) szárítottuk, majd TE pufferben oldottuk.
A PCR-t egy programozható termikus cikluson, "My Cycler" ("Bio = Rad") végeztük, standard oligoprimerek alkalmazásával, szilárd fázisú módszerrel szintetizálva a "Beagler" (Szentpétervár) egyesületnél. A 25 μL térfogatú amplifikálásra szolgáló reakcióelegy tartalmazta: 15 nM mindegyik oligoprimer, 67 mM Tris-HCI, pH = 8,8 +25 ° C-on, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA-t és négy bázikus dNTP elegyét, egyenként 1,0 mM koncentrációban, és hőstabil DNS polimeráz Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Denaturálás után (10 perc, 94 ° C) 35 amplifikációs ciklust végeztünk mindegyik tesztrendszerben: 94 ° C-1 perc, 58 ° C - 1 perc, 72 ° C - 1 perc. A specifitás ellenőrzése céljából a vizsgált lókuszok ismert genotípusával rendelkező DNS mintákat (marker rendszerek), valamint a kontroll mintákat vezettek a reakcióba.amelyek reagensek keverékét tartalmazzák DNS nélkül. Az amplifikáció után a reakcióelegy aliquotjaihoz (7 μl) festőpuffert adtunk, és függőleges elektroforézissel elválasztottuk 6% -os poliakrilamid gélben (210x150x1 mm), etidium-bromiddal megfestettük és ultraibolya fényben fényképeztük. Az allélek azonosításához az ezeknek a lókuszoknak megfelelő alléles standardokat ("létrák") használtunk.
Promóciós videó:
DNS-elemzés
A tanulmányhoz humán DNS exome elemzésének módszerét alkalmaztuk, amely nagy áteresztőképességű szekvenálást és hibridizációval történő dúsítást tartalmaz.
Az emberi DNS exome elemzésének technikája.
2 mintát elemeztünk … A minta előkészítésének minden szakaszát a PCR előtt tiszta helyiségben végezték. A minták előkészítését, a DNS extrakciót és az egyes DNS-fragmentumok amplifikálását különböző helyiségekben végeztük.
A specifikus adaptereket (KAPA Library Preparation Kit és SeqCap Adapter Kit; Roche) a genomi fragmentált DNS végére ligáltuk (~ 5 ng), majd kétlépcsős szelekciót hajtottunk végre 200-350 bp hosszúságtartományban, AMPureXP gyöngyökkel (Beckman Coulter). … A kapott fragmenseket adapter-specifikus primerekkel amplifikáltuk és biotinilezett specifikus próbákkal (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) hibridizáltuk 28 órán át 47 ° C-on. Az egyik reakcióban két DNS-mintát egyesítettünk. A biotinilezett próba-DNS-hibridjeket sztreptovidinnel konjugált mágneses részecskékkel izoláltuk és tisztítottuk; a kapott DNS könyvtár második amplifikációját és kvalitatív értékelését elvégeztük (TapeStation 4200; Agilent Technologies). A célpont nélküli amplifikációs fragmensek és az adapter dimerek eltávolítása céljából a DNS-könyvtárat AMPureXP Beads mágneses részecskékkel újratisztítottuk (1. ábra). Az elkészített könyvtár végső koncentrációját Quantus készüléken egy kereskedelmi QuantiFluor® dsDNA System kit (Promega) felhasználásával értékeljük. A kapott DNS-könyvtárat immobilizáltuk az áramlási sejt felületére. A szekvenálást az Illumina platformon végeztük, Standard Flow Cell és MiSeq Reagent Kit v2 300 alkalmazásával (2x150 ciklus). A kapott DNS-könyvtárat immobilizáltuk az áramlási sejt felületére. A szekvenálást az Illumina platformon végeztük, Standard Flow Cell és MiSeq Reagent Kit v2 300 alkalmazásával (2x150 ciklus). A kapott DNS-könyvtárat immobilizáltuk az áramlási sejt felületére. A szekvenálást az Illumina platformon végeztük, Standard Flow Cell és MiSeq Reagent Kit v2 300 alkalmazásával (2x150 ciklus).
Ábra: 1
A szekvenált DNS minőségének általános értékelése
Az eredeti minőségértékeléshez olyan standard módszereket alkalmaztak, mint a FastQC, valamint a Medúza és a KraTER programok. A minõségértékelés nem mutatott minõségi problémákat a szekvenált DNS-adatokkal mindkét minta esetében. A képek nem jelennek meg, mivel nem informatívak.
Az első mintához (további M, nagy múmia "Maria") a 113.4M leolvasást szekvenáltuk, a második mintához (további W, kicsi múmia "WaWita") a 22.9M leolvasást szekvenáltuk.
A következő lépés a szekvenált leolvasások különböző technikai szekvenciáktól való megtisztítása, amelyek zavarhatják a további elemzést. Ehhez a Cookiecutter programot használták. Tisztítás után 113,3 M (99%) és 22,8 M (99%) volt az M és W érték.
Az ősi DNS mennyiségének becslése és a moderntől való elválasztása
Az ősi DNS jelenlétének és mennyiségének meghatározására szolgáló standard módszer az idővel károsított nukleotidok mennyiségének becslése. Ehhez a MapDamage 2.0 programot használták. A MapDamage 2.0, amely 30,1% -ban megmutatta az ősi DNS mennyiségét, de mivel a MapDamage azt sugallja, hogy szoros referenciát használunk, és nem tudjuk pontosan, milyen közel állnak mindkét minta a modern ember genomjához, és exome könyvtárat használtunk, ez a módszer maga nem volt. elegendő. Az ősi DNS értékelésének másik jó módszere a rövid fragmensek száma.
Az állítólagos ősi DNS szűrésére három szakaszban került sor. Az első szakaszban eltávolítottuk az összes olyan páros leolvasást, amelyet nem lehet átlépni, és összekapcsoljuk egy pár nélkül leolvasott átfedéssel. Ezek az olvasmányok azt mutatták, hogy az eredeti szekvenált fragmentum hosszabb volt, mint 300 bázispár. és valószínűleg a modern DNS. Tehát e lépés után 86,9% és 91,8% maradt. Ezután az egyes átfedő fragmenseket úgy választottuk meg, hogy hosszuk kevesebb legyen, mint 150 bázispár, mivel ezt a hosszúságot vártuk az ősi DNS-re. Ezt a lépést követően az M és W minták esetében 8,6% és 38,5% maradt. Meg kell jegyezni, hogy a százalékos különbség ellenére az M és W minta közötti leolvasások abszolút száma nagyon hasonló: 9,8M és 8,8M, ami azzal magyarázható, hogy az ősi DNS tartalma mindkét mintában hasonló.
| Paraméter | M minta (Maria) | W minta (Wawita) |
| Olvasások száma | 113.3M | 22.8M |
| 300 bp alatti rövid fragmensek százaléka | 86,9% | 91,8% |
|
A 150 bp alatti rövid fragmentumok százaléka (szám) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Az emberi genomban igazított fragmentumok százaléka (szám) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Az emberi genomban igazított fragmentumok százalékos aránya, rövidebb, mint 150 bázispár | 23,8% | 25,6% |
A referencia-emberi genomhoz hasonló DNS előállítása
A kapott feltételezett ősi DNS-t egy referencia-humán genomra térképeztük egy szokásos genomi variáns keresési folyamat segítségével, BWA, samtools és Wcftools felhasználásával.
Ezenkívül az M minta mindössze 23,8% -át és 25,6% -át sikerült feltérképezni a modern emberek referenciagenomjába. Ugyanakkor mindkét mintánál a szekvenált leolvasások 75% -át nem lehetett leképezni az emberi genomban. Ez magyarázható mind a szennyeződéssel, mind azzal, hogy ezek a minták elég messze vannak a modern emberek genomjától. Ugyanakkor érdemes szem előtt tartani, hogy az exóma könyvtárat szekvenáltuk, és ezzel minimalizáltuk a baktérium-DNS szennyeződését.
A nyers olvasmányok első felderítő elemzése azt mutatta, hogy ezek közül néhány a patás állatokra jellemző ismétlődő DNS-hez tartozik, ez azzal magyarázható, hogy a lámazsírt használták az mumifikációhoz.
A részletesebb elemzés megközelítőleg három hetes számításokat igényel, mivel a meglévő megoldásokat csak a vírusos és baktériumok genomjaira állítják elő, és összehasonlítani kell az összes létező genomot, beleértve a növényi genomokat is, hogy megértsük, mely fajok szekvenáltak.
A talált lehetőségek jellemzése
A leképezett leolvasásokat olyan változatok keresésére használták, amelyek megkülönböztetik az M és W mintákat a modern emberi genomból, valamint hogy felmérjék az emberi Y kromoszómából származó leolvasások szennyeződését.
Az első kérdés, amelyet meg kellett válaszolni, az volt, hogy mely kromoszómákra szekvenált beolvasás történt.
Mivel tudjuk, hogy Maria mintáit csontokból és izmokból izolálták, Vavitát csak csontokból, különbséget vártunk az mtDNS mennyiségében. De nem volt sok különbség.
Az Y-n feltárt leképezések száma egy újabb próba a modern ember általi szennyeződésről. Érdekes módon kiderült, hogy mindkét mintában azonos.
A talált változatok statisztikája az alábbiakban látható:
| paraméterek | M minta (Maria) | W minta (Wawita) |
| Talált lehetőségek száma | 79957 | 48941 |
| Opciók száma az Y-n | 534 | 541 |
| A megbízható lehetőségek száma (több mint 20 olvasás és több mint 30 minőség) | 16969 | 6181 |
| Variánsok ismert rsid-kel (elérhető a snip adatbázisban) | 5701 | 3089 |
| Általános érvényes opciók | 92 | |
| általános lehetőségek az rsid-rel | 49 |
Ezt követően válaszolhattunk a kérdésre: M és W rokonok? A válasz nem.
Csak 49 egyező variációt találtak M és W között, és 3040, eltérőek az ismert rsid változatokkal. Sőt, talán ezek egy személy vagy ismeretlen lény különféle típusai vagy alfajai.
Érdekes, hogy az Y kromoszómával rendelkező variánsok mindkét minta esetében azonosak, ami azt jelzi, hogy ugyanaz a személy szennyeződött, és hogy az Y kromoszóma ősi DNS-ben valószínűleg még mindig nincs kromoszóma.
A meglévő szekvenált emberi genomokkal való hasonlóság értékelése az 1000 humán genomprojektből
Vegye figyelembe, hogy ez csak egy megközelítő elemzés, mivel a pontosabb elemzéshez szükség van variánsokra a genomnak a semleges szelekció alatt álló régióiból, és exome-adatokkal rendelkezünk.
Ennek ellenére, 5708 variánsok felhasználásával M vagy 3096 esetén S, lehetségessé vált az elemzés egy variánsának elvégzése az 1000 humán genom adataival összehasonlítva.
Az alábbi képen látható PCA elemzés eredménye az M és a W két képének átfedése, külön-külön kiszámítva, mivel túl kevés közös lehetőség van az M és W között az M és W közötti távolság becsléséhez.
Hasonlósági pontszám.
Mint láthatja, a gének egyik csoportjával sem véletlen egybeesés, ők is különböznek egymástól. De nem szabad megfeledkezni arról, hogy a szekvencia kódolási szekvenciákat használtuk a szelekció alatt, és ajánlott a variánsok használata semleges szelekció alatt.
Ennek ellenére a PCA eredménye jó egyezést mutat a variánsok kézi ellenőrzésével, ami azt mutatta, hogy az adatok nem hivatkozott homozigótában vannak, ami ismét azt jelzi, hogy a képek távol vannak a modern emberi genomtól.
Következtetés
Sajnos csak két mintára korlátozódtunk, általában az ilyen típusú elemzésben többet használnak, legalább 3-10, legalábbis valamilyen módon összefüggőek. Ezért a kutatást nagyszámú mintával kell folytatni.
Ugyanakkor valószínűleg arra a következtetésre juthatunk, hogy Mária és Vavita DNS-mintái megfelelnek az emberi DNS-nek, de nem esnek egybe azzal a DNS-szel, amely az 1000 ember adatbázisából rendelkezésre áll.
A jelentés szerzői: Baranov V. S. és Aseev M. V. (Szülészeti és nőgyógyászati Kutatóintézet, Prenatális Diagnosztika Tanszék), Glotov A. S. és Glotov O. S. (Szentpétervári Állami Egyetem), Komissarov A. S. (Citológiai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Genetikai Bioinformatikai Központ).
Anyagok: Konstantin Georgievich Korotkov (műszaki tudományok doktora, egyetemi tanár, Informatikai Egyetem, Mechanika és Optika) és Dmitrij Vladislavovics Galetsky (Orvostudományi jelölt, I. Pavlov I. Szentpétervár Állami Orvostudományi Egyetem).
A Nazca múmiákról bővebben lásd a Nazca múmia címkét.